Ассоциация увеличения возраста с уменьшением элементов повтора теломер, обнаруженных в конце хромосом, хорошо документирована. Это усиливает необходимость разработки эффективных методов смягчения влияния старения на самочувствие человека.
В настоящем исследовании ученые определили влияние высокоемкого цитомегаловирусного вектора (ЦМВ) на такие факторы, как фоллистатин (FST) и обратная транскриптаза теломеразы (ТРЕТ), которые защищают от влияния старения на здоровье человека.
Команда разработала вектор CMV мыши (MCMV), который экспрессировал люциферазу в качестве репортерного гена (MCMVLuc), чтобы наблюдать инфекцию MCMV и ее репликацию в культуре, а также в модели мыши. Реплицированный MCMVLuc вместе со своим родительским вирусом использовался в этом исследовании в качестве инокуляции вируса MCMV дикого типа (WT) или вирусного векторного контроля. Команда также генерировала рекомбинантные векторы MCMV, которые экспрессировали помеченные флагом гены обратной транскриптазы теломеразы (TERT) и FST (MCMVTERT и MCMVFST).
Кроме того, команда слила мышиный ТРЕТ с ФЛАГ-меткой на C-конце, используя две промежуточные аминокислоты, а именно аргинин и треонин. Кинетику экспрессии целевого белка и терапевтическую эффективность ЦМВ определяли путем оценки уровней ТРЕТ в образцах крови восьмимесячных мышей в течение месяца после лечения.
Продление жизни после лечения оценивали путем введения семи из девяти групп пожилых самок мышей с имитационным лечением внутрибрюшинно (IP), WT-обработанным интраназально (IN) (WT-IN), WT-IP, MCMVTERT-IN, MCMVTERT-IP, MCMVFST-IN и MCMVFST-IP, соответственно. Лечение было впервые начато у 18-месячных мышей. Команда принесла в жертву одну мышь в каждой группе через 24 месяца для проведения анализа ткани, в то время как остальные мыши контролировались на предмет изменений в их физиологии до их естественной смерти.
Кроме того, была определена длина теломер в почках и мышечных тканях, и были проведены сравнения между ними в разных группах мышей с использованием количественной флуоресцентной гибридизации in situ (Q-FISH). Команда также оценила длину теломер, наблюдаемую в скелетных мышцах мышей, получавших ТРЕТ. Длину теломер различных органов также оценивали с использованием количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (qPCR).
Результаты
Результаты исследования показали, что помеченные флагом гены MCMVTERT и MCMVFST реплицировались в степени, сопоставимой с MCMVLuc (WT) в клетках фибробластов у мышей и in vivo. Экспрессия белка TERT при введении в или IP была самой высокой через семь дней после лечения, а затем постепенно снижалась до базального уровня на 25-й день. Это указывало на то, что вектор был способен доставлять белки в среде in vivo. Анализ рибонуклеиновых кислот (мРНК) и белков мессенджеров FST и TERT в образцах крови и тканей, полученных от обработанных животных.
Анализ влияния лечения на продление жизни показал, что мыши WT умерли после медианы продолжительности 26,7, 26,5 и 26,4 месяцев. Средний возраст смерти мышей, получавших MCMV FST, и мышей, получавших MCMVTERT, составлял 35,1 и 37,5 месяцев соответственно. Команда отметила, что самая длинная продолжительность жизни наблюдалась у мышей, получавших MCMV TERT, — 41,2 месяца, в то время как у мышей, получавших MCMVFSTобработанные мыши составляли 38,0 месяца. Команда отметила, что ЦМВ-терапия была сопоставима по эффективности независимо от пути инокуляции, что наводило на мысль о том, что взаимодействие вектора с иммунной системой существенно не влияло на экспрессию генов.
Результаты метода Q-FISH показали увеличение длины теломер в почках мышей, получавших ТРЕТ, в 3,1 раза по сравнению с необработанными контрольными мышами. Кроме того, количество теломер, наблюдаемых в почках мышей, получавших ТРЕТ, было значительно выше, чем у необработанных мышей или мышей, получавших WT. Примечательно, что никаких существенных изменений не было обнаружено у субъектов, получавших FST или WT, которые предполагали эффективность ТРЕТ у мышей, получавших ТРЕТ.
Команда также наблюдала, что длина теломер в мышечных тканях мышей, получавших ТРЕТ, увеличилась почти в три раза по сравнению с таковыми у необработанных субъектов. Напротив, не было существенного увеличения длины теломер у мышей, получавших FST или WT. Кроме того, qPCR не показал различий в длине теломер в различных тканях мышей, получавших ТРЕТ. Команда отметила, что относительная длина теломер в мозге, сердце, легких, печени и почках у 24-месячного MCMVTERT обработанных мышей было почти в три раза больше, чем у необработанных мышей того же возраста.
Заключение
В целом, результаты исследования показали важность изучения влияния использования векторов CMV TERT и FST на условия, связанные со старением, такие как хронические воспалительные заболевания, саркопения, диабет 2 типа и сердечные заболевания.