Современные методы моделирования или коррекции мутаций в живых клетках неэффективны, особенно при мультиплексировании, т.е. одновременной установке нескольких точечных мутаций по всему геному. Исследователи из Калифорнийского университета в Сан-Диего разработали новые, эффективные инструменты редактирования генома, называемые мультиплексными редакторами ортогональных оснований (MOBE), для одновременной установки нескольких точечных мутаций.
Их работа, проведенная лабораторией доцента химии и биохимии Алексиса Комора, опубликована в журнале Nature Biotechnology.
Команда Комора была особенно заинтересована в сравнении геномов, которые различаются при изменении одной буквы в ДНК. Эти буквы — С (цитозин), Т (тимин), G (гуанин), А (аденозин) — известны как основания. Там, где у одного человека есть основание С, у другого человека может быть основание Т. Это однонуклеотидные варианты (SNV) или одноточечные мутации. У человека может быть 4–5 миллионов вариантов. Некоторые варианты безвредны; некоторые из них вредны; И часто именно комбинация вариантов приводит к заболеванию.
Одной из проблем, связанных с использованием генома в моделировании заболеваний, является огромное количество возможных вариаций. Если бы ученые пытались определить, какие генетические мутации ответственны за сердечные заболевания, они могли бы расшифровать геномы когорты, у которой были сердечные заболевания, но количество вариаций между любыми двумя людьми делает очень трудным определить, какая комбинация вариаций вызывает заболевание.
«Существует проблема интерпретации генетических вариантов. На самом деле, большинство идентифицированных вариантов не классифицируются клинически, поэтому мы даже не знаем, являются ли они патогенными или доброкачественными», — заявил Куинн Т. Коуэн, недавний выпускник факультета химии и биохимии университета и первый автор статьи.
«Наша цель состояла в том, чтобы создать инструмент, который можно использовать для моделирования заболеваний, установив несколько вариантов в контролируемых лабораторных условиях, где их можно будет изучать дальше».
Чтобы понять, почему были созданы MOBE, мы должны понять ограничения традиционного инструмента редактирования генов CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 использует направляющую РНК, которая действует как сигнал GPS, который направляется прямо в геномное место, которое вы хотите отредактировать. Cas9 — это ДНК-связывающий фермент, который разрезает обе нити ДНК, полностью разрывая ее.
Несмотря на относительную простоту, двухцепочечные разрывы могут быть токсичными для клеток. Этот вид редактирования генов также может привести к случайным вставкам и делециям, когда клетка не в состоянии полностью восстановить себя. Редактирование нескольких генов в CRISPR-Cas9 многократно увеличивает риски.
Вместо CRISPR лаборатория Комор использует разработанную ею технику редактирования оснований, которая вносит химические изменения в ДНК, хотя за один раз может быть выполнен только один тип редактирования (например, C в T или A в G). Таким образом, вместо ножниц, которые вырезают сразу весь раздел, базовое редактирование стирает и заменяет одну букву за раз. Он медленнее, но эффективнее и менее вреден для клеток.
Одновременное применение двух или более редакторов оснований (изменение C на T в одном месте генома и A на G в другом месте генома) позволяет лучше моделировать полигенные заболевания, возникающие из-за более чем одного генетического варианта. Однако не существовало технологии, которая могла бы сделать это эффективно без «перекрестных помех» направляющей РНК, которые происходят, когда базовые редакторы вносят нежелательные изменения.
MOBE Коуэна используют структуры РНК, называемые аптамерами — небольшие петли РНК, которые связываются с определенными белками — для рекрутирования ферментов, модифицирующих основания, в определенные участки генома, что позволяет одновременно редактировать несколько сайтов с высокой эффективностью и меньшей частотой перекрестных помех.
Эта система является новой, и это первый случай, когда кто-то использовал аптамеры для рекрутирования ABE (редакторов аденозиновых оснований) в сочетании с CBE (редакторами цитозиновых оснований) в ортогональном паттерне для создания MOBE.
Различия разительны: когда CBE и ABE даются вместе без использования MOBE, перекрестные помехи возникают до 30% времени. При использовании MOBE перекрестные помехи составляют менее 5% при достижении 30% эффективности преобразования желаемых изменений базы.
Исследование стало принципиальным доказательством осуществимости системы MOBE, на которую был выдан предварительный патент. Чтобы проверить их еще больше, команда провела несколько тематических исследований с реальными заболеваниями, включая синдром Кальмана, редкое гормональное расстройство. Их эксперименты показали, что системы MOBE могут быть использованы для эффективного редактирования соответствующих клеточных линий некоторых полигенных заболеваний.
«Мы находимся в процессе размещения плазмид на AddGene, чтобы любой желающий мог получить к ним свободный доступ. Мы надеемся, что другие исследователи будут использовать MOBE для моделирования генетических заболеваний, изучения того, как они проявляются, а затем, надеюсь, создадут эффективные методы лечения», — заявил Коуэн.