SARS-CoV-2 постоянно развивается, и все его вызывающие озабоченность варианты содержат мутации в рецепторсвязывающем домене (RBD) его гликопротеина spike (S), что делает неэффективными все вакцины против коронавирусной болезни 2019 (COVID-19) и терапию моноклональными антителами.
Существует настоятельная потребность в более эффективных противовирусных препаратах против SARS-CoV-2, особенно тех, которые нацелены на структуры и менее подвержены мутациям (например, гептадный повтор 1 и 2 (HR1-HR2) шестигранный пучок SARS-CoV-2 S).
Ранее исследователи использовали несколько структурных инженерных подходов для создания более эффективных ингибиторов на основе HR2 на основе 36 аминокислотных сегментов остатков SARS-CoV-2 S 1168-1203.
В настоящем исследовании исследователи обнаружили, что немодифицированный пептид SARS-CoV-2 HR2, охватывающий S-остатки 1162-1203, называемый longHR2_42, обладал значительно улучшенными ингибирующими SARS-CoV-2 свойствами по сравнению со всеми предыдущими попытками. Они охарактеризовали пучок HR1-HR2 с использованием метода молекулярных каркасов для определения его структуры с помощью криоэлектронной микроскопии высокого разрешения (cryo-EM) longHR2_45, связанного с HR1.
Затем они разработали расширенный пептид HR2 с более длинной N-концевой областью, охватывающей аминокислотные остатки 1159-1179, используя Coot, который достиг ингибирования SARS-CoV-2 в наномолярном (нМ) диапазоне. Они усовершенствовали структуру в Rosetta, используя протокол автоматического уточнения структуры. Аналогичным образом, они оценивали образование комплекса HR1-HR2 с использованием собственной флуоресценции при электрофорезе в прозрачном нативном полиакриламидном геле (CN-PAGE).
Исследователи разработали два анализа для выявления образования комплексов между вариантами HR2 и HR1 и анализ слияния клеток с клетками для проверки влияния N-концевого удлинения HR2 на ингибирование функции слияния мембран SARS-CoV-2 S.
В первом анализе использовали клеточную поверхность Escherichia coli для отображения пептидов HR2 на усиленном кольцевом каркасе белка OmpX (eCPX)-белка. Затем исследователи инкубировали эти клетки с зеленым флуоресцентным белком (GFP), помеченным HR1, и GFP-позитивными клетками, экспрессирующими пептиды HR2, которые связывали HR1, которые они отбирали с помощью сортировки клеток, активируемых флуоресценцией (FAC). Во втором анализе использовался дисплей рибонуклеиновой кислоты (мРНК) для обнаружения образования комплекса HR2-HR1.
Результаты исследования
Новый N-концевой удлиненный пептид HR2, разработанный в текущем исследовании, показал ~ в 100 раз более сильное ингибирование всех основных вариантов SARS-CoV-2 со значением полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC 50) ≈ 1 нМ, что было оценено с помощью анализа слияния на основе клеток. Примечательно, что он обладал в 10 раз меньшей ингибирующей активностью против варианта Омикрона. Три мутации в области HR1 Омикрона – Q954H, N969K и L981F — все вложенные в область между HR1 и N-концевым расширением HR2, объясняют более слабую ингибирующую активность longHR2_42.
Исследователи отметили, что longHR2_42 не показал соответствующего увеличения кажущегося сродства к HR1 во всех трех анализах связывания, описанных в исследовании. Тому же есть два возможных объяснения. Во-первых, эти анализы были недостаточно чувствительны, чтобы обнаружить незначительные изменения аффинности. Однако более вероятно, что другие факторы повлияли на эффективность пептидов, полученных из HR2, против SARS-CoV-2.
Выводы
Спиральная область HR2 SARS-CoV-2 S показала потенциал в качестве источника мощных пептидных анти-SARS-CoV-2 терапевтических средств, которые будут работать против его ЛОС и более отдаленно родственных вирусов. Кроме того, пептид longHR2_42 обладал длительным временем ингибирования (более трех часов), несмотря на вымывание в анализах на вирусную инфекцию, что позволяет предположить, что он нацелен на промежуточный продукт перед шпилькой белка SARS-CoV-2 S. Действительно, данные исследования предоставили дополнительную поддержку промежуточному продукту, предшествующему шпильке, гликопротеина SARS-CoV-2 S.
По мнению авторов, удлинение пептидной последовательности longHR2_42 может повысить ее эффективность. Кроме того, оптимизация его последовательности может еще больше улучшить его активность и обеспечить платформу для разработки других новых пептидов, специфичных к варианту SARS-CoV-2.